Методичний посібник з практичних навичок для студентів, що навчаються на кафедрі гістології.
Практичні навички отримуються на кафедрі гістології
Техніка микроскопирования з різними об'єктивами: х8, х40, х90.
Читання гістологічних препаратів
Техніка гістологічного малюнка
Освоєння техніки гістологічного фарбування гематоксилін - еозином
Аналіз електроннограмм і граф-логічних структур.
Діагностика гістологічних структур на мікропрепаратах
Техніка читання мазка периферичної крові людини і підрахунку лейкоцитарної формули.
Складання протоколу досліджуваного гістологічного препарату.
профілізація
Студентам стоматологічного факультету диференціювання на мікропрепаратах тканин, складових зуб.
Студентам педіатричного факультету: діагностика мазка периферичної крові дитини різних вікових груп.
Правила роботи з мікроскопом
Поставити мікроскоп в зручне для роботи положення і вибрати джерело освітлення
Привести мікрогвинт в робоче положення-точка на лівій стороні штатива повинна знаходиться по середині між двома ризиками
Поставити об'єктив малого збільшення на 8 в центральне положення, обертаючи револьвер за годинниковою стрілкою.
Домогтися рівномірного освітлення верхньої лінзи конденсора, користуючись увігнутим дзеркалом.
Перевірити рівномірність освітлення поля зору через окуляр мікроскопа.
Помістити препарат покривним склом догори на предметний столик мікроскопа
Встановити об'єктив малого збільшення на відстані 0,8-1,0 см. Від препарату, працюючи мікрогвинти. Під контролем очі домогтися чіткості зображення
Встановити об'єктив великого збільшення на 40 в центральне положення, обертаючи револьвер за годинниковою стрілкою
Домогтися чіткості зображення, працюючи мікрогвинти (2-5 оборотів), в напрямку найчастіше на себе, рідше від себе.
Коли робота буде виконана перевести револьвер в неробочий стан і прибрати препарат.
Читання гістологічного препарату Схема протоколу описі гістологічного препарату по приватної гістології
Назва препарату
Забарвлення препарату (гематоксилін-еозин, орсеїном, залізний гематоксилін, і т.д.)
Принцип будови органу
I Шарувато -оболочечний:
Кількість оболонок;
Назва кожної оболонки;
Шари в оболонках з назвою тканин їх утворюють. Вказати морфологічні особливості тканин в шарах даного органу. Вказати джерела походження тканин
Інші структури в оболонці, шарі (залози, кровоносні і лімфатичні судини, нервові стовбури, інтрамуральні ганглії, лімфоїдні фолікули із зазначенням їх харафктерних морфологічних ознак.
II Паренхіматозний
Капсула - назвати тканину,
Трабекули - назвати тканину,
Кровоносні судини (артерії, вени), нервові стовбури, інтрамуральні ганліі.
2. Паренхіма
Назвати вид тканини, що становить основу паренхиматозного органу (епітеліальна, ретикулярна)
Назвати і описати основні структурні одиниці паренхіми (наприклад: нефрон, лімфоїдний фолікул, секреторний відділ залози, епітеліальні тяжі, ацинус і т.д.) або основні частини паренхіми (наприклад: біла і червона пульпа в селезінці; коркова і мозкова речовина, зони)
Техніка читання мазка периферичної крові людини і підрахунку лейкоцитарної формули
Мазок крові людини забарвлення за методом Романовського
Навчитися визначати еритроцити в мазку крові-еритроцит має відносно постійний діаметр (7,5мкм), не містить ядра, забарвлений еозином в рожевий колір (оксіфілен), в центрі виявляється невелика просвітлення за рахунок истончении.
Навчитися визначати лейкоцити, вони крупніше еритроцитів за розміром, мають ядро, їх набагато менше, ніж еритроцити. Знайти при великому збільшенні паличкоядерні, сегменоядерние, нейтрофільні лейкоцити, еозінофіьние, базофільні гранулоцити, лімфоцити, моноцити.
Навчитися знаходити і визначати тромбоцити, в 2-3 рази менше еритроцита, зазвичай зібрані в групи.
Підрахунок лейкоцитарної формули
Підрахувати при збільшенні 100 лейкоцитів, визначивши їх приналежність до тієї чи іншої групи на увазі вивчених раніше клітин. Щоб не робити підрахунку в одному і тому ж ділянці, просто рукою в такий спосіб потрібно пересувати препарат гвинтами предметного столика або
Освоєння техніки гістологічного фарбування гематоксилін еозином
1.1. світлова мікроскопія
1.1.1. пристрій мікроскопа
1.1.2. Приготування гістологічного препарату
1.1.2.1. Взяття і фіксація матеріалу
1.1.2.2. Зневоднення і ущільнення матеріалу
1.1.2.3. приготування зрізів
1.1.2.4. Фарбування препаратів і висновок в консервирующую середу
1.1.3. Методи фарбування гістологічних препаратів
1.1.3.1. типи барвників
1.1.3.2. Загальні методи забарвлення
1.1.3.3. Виявлення неклітинних структур сполучної тканини
1.1.3.4. Забарвлення клітин сполучної тканини і крові
1.1.3.5. Виявлення елементів нервової системи
1.2. Електронна мікроскопія
1.2.1. Принцип роботи електронного мікроскопа
1.2.2. Особливості приготування препарату
У гістології, цитології та ембріології існує багато методів дослідження.
Тут розглядаються лише ті, які пов'язані зі світлової та електронної мікроскопії мертвих (фіксованих) клітин і тканин.
1.1. світлова мікроскопія
1.1.1. пристрій мікроскопа
1. Схема - будова світлового мікроскопа.
У мікроскоп входять 3 системи -
оптична,
освітлювальна та
механічна.
1. Оптична система включає об'єктив і окуляр.
а) Об'єктив (1) - це система лінз, що вставляється в тубус (2) знизу і безпосередньо спрямовується на об'єкт (звідси - і назва).
Звичайні збільшення об'єктива:
8. 20. 40 (сухі об'єктиви), 90 (іммерсійний об'єктив).
При використанні останнього об'єктива його слід занурити в краплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесену на покривне скло препарату.
б) Окуляр (3) вставляється в тубус зверху. Застосовуються окуляри зі збільшенням
7, 10, 15.
в) Результуюче збільшення мікроскопа - твір збільшень об'єктива і окуляра, наприклад:
2. Освітлювальна система - джерело світла, дзеркало, конденсор і діафрагма.
а) Джерело світла (4) може бути вбудований в мікроскоп, а може знаходитися і поза мікроскопа (приклад - звичайна настільна лампа).
б) Дзеркало (5) збирає промені від джерела і направляє їх на препарат знизу.
Одна поверхню дзеркала - плоска, друга - увігнута;
остання використовується при штучному освітленні.
в) Конденсор (6) складається з лінз, які фокусують промені світла на препараті. Піднімаючи і опускаючи конденсор (за допомогою гвинта), можна налаштовувати фокусування променів.
г) Діафрагма (7) вмонтована в конденсор; це система непрозорих пластинок з отвором посередині.
Вона обмежує світловий потік, що падає на препарат.
При використанні об'єктивів з великим збільшенням отвір діафрагми слід зменшити - для ослаблення сферичної аберації.
3. Механічна система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) і предметний столик (10).
а) З колонкою пов'язані макро- і мікрометричний гвинти, які піднімають і
опускають тубус для фокусування зображення об'єкта на сітківці ока спостерігача.
Макровінт використовується при роботі на малому збільшенні, а мікрогвинт - на великому.
б) Предметний столик може переміщатися в горизонтальній площині, що дозволяє змінювати ділянки препарату, що потрапляють в поле зору.
У підсумку, світлові промені проходять наступний шлях:
джерело світла (4) дзеркало (5) конденсор (6) діафрагма (7)
препарат об'єктив (1) тубус (2) окуляр (3).
Тобто мікроскопія ведеться в світлі, для чого препарат повинен бути досить тонким.
Зауважимо також, що мікроскоп дає перевернуте зображення об'єкта.
1.1.2. Приготування гістологічного препарату
1. За характером взятого матеріалу розрізняють наступні види гістологічних препаратів:
а) зрізи органів (товщиною 5-15 нм),
б) мазки (крові, кісткового мозку і т.д.),
в) плівки (очеревини, м'якої мозкової оболонки), або тотальні препарати
Найчастіше використовуються зрізи.
2. Приготування препарату зазвичай включає 4 наступних етапи:
а) взяття і фіксація матеріалу,
б) зневоднення і ущільнення матеріалу,
в) приготування зрізів,
в) фарбування препаратів і висновок в консервирующую середу.
1.1.2.1. Взяття і фіксація матеріалу
1. З відповідного органу вирізують невеликі шматочки (0,5 x 1 x 1 см) і занурюють їх у фіксатор (формалін, метанол і т.д.) - зазвичай на 24 год.
2. Фіксація проводиться для попередження процесів аутолізу (самопереваріванія) тканин. Це досягається шляхом денатурації (коагуляції) білків.
3. Після фіксації зразки промивають проточною водою протягом декількох годин.
1.1.2.2. Зневоднення і ущільнення матеріалу
1. Потім зразки ущільнюють - щоб в подальшому їх можна було різати на мікротому.
Часто в якості ущільнювача використовують парафін або целлоидин.
2. Попередньо зразки зневоднюють (інакше гідрофобний ущільнювач не зможе проникнути в тканину).
а) Для цього їх "проводять" по батареї спиртів -
70%. 80%. 96%. 100% етанол -
по 24 години в кожному спирті.
б) Оскільки парафін не розчинний і в етанолі, зразки витримують потім в суміші етанол-ксилол і в чистому ксилоле.
3. а) Заливка: поміщають зразки в суміш ксилол-парафін і потім в рідкий парафін
на 1-2 ч при 52-56 о С.
б) Дають парафіну, охолоджуючись, затвердіти; вирізують з нього блок з ув'язненим зразком і закріплюють на дерев'яному кубику.
1.1.2.3. приготування зрізів
1. Кубики вставляють в спеціальний прилад - мікротом, - службовець для приготування зрізів.
2. а) За допомогою мікрометричною механічної системи об'ектодержатель разом з кубиком переміщається за кожен крок на певну відстань (напр. 10 мкм).
б) А мікротомних ніж, що направляється під кутом до поверхні парафинового блоку, зрізає з нього тонкої шар органу (зріз) заданої товщини.
3. Зрізи поміщають на поверхню теплої води для їх розправлення, а потім - на предметне скло.
1.1.2.4. Фарбування препаратів і висновок в консервирующую середу
1. Перед фарбуванням зразки звільняють від парафіну, проводячи по батареї розчинників:
ксилол, спирт 100%, 96%, 80%, 70%, 60%, вода (по 2-5 хв)
(Цей ряд закінчується водою в тому випадку, якщо потім використовується водорозчинний барвник.)
2. Для фарбування предметні стекла зі зрізами поміщають на короткий час
в розчин барвника, промивають водою, обробляють розчином іншого барвника
(Якщо такий використовується теж) і знову промивають водою.
3. Препарат знову зневоднюють (проводячи по батареї спиртів зі зростаючою концентрацією),
а потім прояснюють (в карбол-ксилолі і ксилоле) - для видалення зайвої фарби.
4. Нарешті, на препарат наносять краплю канадського бальзаму (в разі зрізу) або
кедрового масла (на мазки крові) і накривають покривним склом.
Таким чином, приготування гістологічного препарату - дуже довга і
трудомістка процедура.
Але при правильному її виконанні отриманий препарат може зберігатися невизначено довгий час.
1.1.3. Методи фарбування гістологічних препаратів
1.1.3.1. типи барвників
Всі барвники, що використовуються в гістологічної техніки, підрозділяються на 3 тіпа.-
3. Хід променів в електронному мікроскопі, в принципі, такий же, як в световом.-
а) Джерелом електронів служить катод (1),
а рушійною силою - різниця потенціалів між катодом і анодом (2).
б) Анод розташований поблизу катода і має отвір посередині, через яке проскакують електрони.
в) Щоб їх потік далі не слабшав, в тубусі мікроскопа створюється високий вакуум.
4. а) Одна електромагнітна котушка (3) служить в якості конденсора (фокусує пучки на зразку (4)),
б) друга котушка (5) - в якості об'єктива (приймає промені, що розходяться від зразка),
в) а третя котушка (6) - в якості окуляра, або проекційної лінзи.
5. Промені, що проходять через останню котушку, потрапляють далі на люмінесцентний екран (7) і викликають його світіння в місці падіння електронів.
1.2.2. Особливості приготування препарату
Матеріал беруть дуже маленькими шматочками (близько 1 мм 3),
а фіксацію здійснюють зазвичай в 2 стадії:
а) спочатку глутаральдегідом (стабілізація білків),
б) потім - четирёхокісью осмію (стабілізація фосфоліпідів і контрастування тканини).
2. Ущільнення матеріалу
1. Зразки, як зазвичай, зневоднюють,
а для їх подальшого ущільнення використовують епоксидні смоли.
2. а) Заливання виробляють в спеціальних формах,
б) затвердіння суміші відбувається шляхом її полімеризації в термостаті,
в) і затверділі блоки мають вигляд маленьких свічок.
1. Зріз роблять за допомогою ультратома;
їх товщина - 30-50 нм (пор. з мікротомних зрізами - 10.000 - 20.000 нм).
2. Потім їх переносять на сіточки (грають роль предметного скла).
1. а) Фарбування зрізів зводиться до їх контрастування за допомогою солей важких металів (свинцю, вольфраму, урану).
б) Ці солі осідають на фосфолипидах мембран і поглинають електрони.
2.Поетому відповідні місця клітини виглядають більш темними.
Посібник з практичних навичок для студентів, що навчаються на кафедрі гістології