При культивуванні рослинних тканин і клітин особливе значення надається стерилізації інструментів і поживних середовищ. Скляний посуд піддають дії сухого гарячого повітря або насиченого водяної пари. З цією метою застосовують кілька варіантів стерилізації: посуд нагрівають в сухожарові шафах до температури 180 ° С (експозиція 30 хв) або 160 ° С (експозиція 60 хв) або витримують при температурі 105 ° С протягом 4-5 год. Крім того, додаткову стерилізацію посуд проходить і під час автоклавування середовища.
Скляний посуд, в якій була виявлена грибкова або бактеріальна інфекція, слід спочатку промити в теплій воді з додаванням детергентів, а потім залишити на кілька годин, налив в неї хромовую суміш (хромпик). Остання має сильно виражені окисні властивості. Замість хромової суміші можна використовувати гідроксид натрію або кристалічну соду. Потім посуд слід 6 разів прополоскати у проточній воді, 2 рази - в дистильованої воді і помістити на 2 ч в сушильну шафу при температурі 105 ° С.
Металеві інструменти, службовці для виокремлення експлантов і різних маніпуляцій з ними (леза, скальпелі, пінцети), а також скляні стакани, чашки Петрі перед обробкою потрібно загорнути в папір і піддати автоклавированию при тиску 2 атм і температурі 121 ° С протягом не менше 60 хв. Після стерилізації всі матеріали слід добре висушити методом ежекції.
Існують два основних способи стерилізації поживних середовищ - автоклавирование і фільтрування. У першому випадку приготований розчин розливають в попередньо простерилізованих в сушильному шафі посуд для культивування, а потім стерилізують в автоклаві при тиску 0,75-0,9 атм (температура 110-115 ° С) протягом 20-25 хв. Можна спочатку методом автоклавування простерилізувати велику кількість середовища в одному обсязі, а потім в ламінарному боксі розлити її в стерильну посуд для культивування. Однак, на наш погляд, останній варіант більш трудомісткий. Крім того, при такому способі розливу середовища збільшується ймовірність її інфікування. Подібна послідовність дій більш прийнятна при невеликій кількості середовища.
У другому випадку використовують стерильні фільтри Зейтца, Беркефельда, свічки Шамберлана, мембранні фільтри, незамінні для приготування середовищ з термолабільними компонентами (деякі стимулятори росту, вітаміни, антибіотики, амінокислоти, рослинні екстракти), які руйнуються при авто- клавірованіі. Фільтрація середовищ (холодна стерилізація) застосовується також для приготування сумішей ферментів і виділення ізольованих протопластів, середовищ з біологічно активними компонентами, рідких середовищ.
Живильні середовища, що містять органічні добавки, такі, як кокосове молоко, картопляний відвар і ін. Дезінфікують шляхом фільтрування, використовуючи спеціальні фільтри з діатомової землі, плавленого скла або складних ефірів целюлози.
Однак повної стерилізації можна досягти лише в процесі тиндалізація, яку зазвичай проводять в апараті Коха. Суть методики полягає в 2-3-кратному нагріванні посуду водяною парою до температури 90-100 ° С з 24-годинними інтервалами. Перше нагрівання призводить до знищення вегетативних форм, а наступні - до загибелі мікроорганізмів, які утворилися при температурі 25 ° С з склероция в перервах між нагріву.
Тиндалізація також використовують для стерилізації поживних середовищ, що містять сполуки, які руйнуються при високих температурах (наприклад, гібереліни инактивируются при температурі вище 90 ° С). Те саме можна сказати і до цукру, які карамелізіруется при високих температурах.
Час термічної дезінфекції залежить від обсягу посуду, в яку розлита живильне середовище. Пробірки із середовищем стерилізують 15 хв при температурі 115 ° С. Колби, що містять 100-500 мл живильного середовища, дезінфікують 30 хв при температурі 121 ° С і 45 хв при температурі 115 ° С. Колби, в яких знаходиться від 500 до 5000 мл живильного середовища, стерилізують в автоклаві протягом 35-40 хв при температурі 121 ° С і 50 хв при температурі 115 ° С.
Обсяг посуду, мл
Час стерилізації при 121 ° С (1 атм), хв
Після закінчення стерилізації середовища в камері автоклава потрібно поступово зменшувати тиск і температуру. Кришку автоклава необхідно відкривати тільки після того, коли стрілка манометра встановиться на позначці "0". В іншому випадку, при різкій зміні тиску, середовище може моментально закипіти, Випліскуючись з судин, в яких проводилася стерилізація, і змочуючи кришки (це може привести до додаткового інфікування). У той же час потрібно стежити за тим, щоб автоклав був розгерметизовано в момент встановлення стрілки манометра на позначці "0"; інакше кришку автоклава може засмоктати внаслідок формування градієнта тисків. Якщо це сталося, потрібно короткочасно (на 1,5-2 хв) включити тумблер автоклава, після чого кришку стерилізаційної камери можна без зусиль відкрити.
Посуд з живильним середовищем після стерилізації поміщають в спеціальний шафа для зберігання готових поживних середовищ і витримують протягом 3-5 діб для виявлення грибкової або бактеріальної інфекції.
Для закупорювання культуральних судин можна застосовувати різні пробки. Сьогодні поширена одноразовий пластиковий посуд, проте крім неї в побуті широко використовують стандартні банки об'ємом 250 мл з бляшаними кришками, колби Ерленмейера (на 250 мл) та ін. В жерстяних кришках проробляють отвори діаметром 0,5-0,8 мм і вставляють в них поролонові пробки (для вентиляції). Крім того, це допомагає усунути градієнт тисків при стерилізації живильного середовища. Якщо в роботі використовують ватно-марлеві пробки, їх можна додатково захистити від проникнення інфекції ковпачками з фольги. Алюмінієва фольга дуже зручна в зверненні і її часто застосовують; вона забезпечує достатню вентиляцію культурального судини і в той же час перешкоджає швидкому висиханню живильного середовища. Пробки з поліуретану, що використовуються для закривання пробірок і колб, слід спочатку вимити в гарячій воді з додаванням невеликої кількості детергенту, потім кілька разів прополоскати у водопровідній воді, потім - в дистильованої. Сушать їх при температурі 105 ° С протягом 2,5-3 год. Подібної процедурі піддають і кришки з алюмінієвої фольги, попередньо перевіривши їх цілісність
Створення дизайну сайту і розробка Para-Diz.com.ua