Мета мікробіологічних досліджень - встановити факт наявності або відсутності збудника в організмі хворого і на об'єктах навколишнього середовища.
Завдання мікробіологічних досліджень - ідентифікувати мікроорганізми в досліджуваному матеріалі, визначити їх видову приналежність, морфологічні, біохімічні, токсигенні і антигенні властивості, а також встановити чутливість виділених мікроорганізмів до антимікробних препаратів. Незважаючи на те, що проведення мікробіологічних досліджень відноситься до компетенції мікробіологів, кожен лікар, що має справу з інфекційними захворюваннями, повинен знати, як і коли необхідно відбирати матеріал для досліджень, на які дослідження його направляти і як інтерпретувати отримані результати.
Перший етап будь-якого мікробіологічного дослідження становить правильний вибір матеріалу для дослідження. Його визначають властивості збудника і патогенез викликається ним захворювання. При ураженнях окремих органів і систем доцільно відбирати матеріал відповідної локалізації. При відсутності поразок досліджують кров, а потім відбирають зразки з урахуванням клінічної картини захворювання і доступності матеріалу для дослідження. Так при лихоманці неясного генезу спочатку проводять посів крові; потім, при появі симптомів більш конкретних проявів, наприклад, пневмонії, проводять забір мокроти.
• Зразки слід забирати до призначення антимікробної терапії, з дотриманням правил асептики для запобігання забрудненню матеріалу. Кожен зразок слід розглядати як потенційно небезпечний. При заборі, транспортуванні, зберіганні і роботі з ним необхідно дотримуватися правил біологічної безпеки. Матеріал збирають в обсязі, достатньому для всього комплексу досліджень. Мікробіологічні дослідження слід починати негайно після надходження зразка в лабораторію.
• Вибір матеріалу для дослідження повинен відповідати характеру інфекційного процесу. Так, наприклад, при встановленні етіології пневмонії матеріалом повинна бути мокрота, а не слина, а при ранових інфекціях виділення слід забирати з глибини рани, а не з її поверхні.
Вибір лабораторних досліджень
Основу мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань складають мікроскопічні, мікробіологічні, біологічні, серологічні та алергологічні методи.
Мікроскопічні методи включають приготування мазків і препаратів для микроскопирования. У більшості випадків результати мікроскопічних досліджень носять орієнтовний характер (наприклад, визначають ставлення збудників до фарбування), так як багато мікроорганізмів позбавлені морфологічних ітинкторіальних особливостей. Проте, мікроскопією матеріалу можна визначити деякі морфологічні ознаки збудників (наявність ядер, джгутиків, внутрішньоклітинних включень і т.д.), а також встановити факт наявності або відсутності мікроорганізмів в надісланих зразках.
Мікробіологічні методи - «золотий стандарт» мікробіологічної діагностики, так як результати мікробіологічних досліджень дозволяють точно встановити факт наявності збудника в досліджуваному матеріалі. Ідентифікацію чистих культур (до виду мікроорганізму) проводять з урахуванням морфологічних, тинкторіальних, культуральних, біохімічних, токсигенних і антигенних властивостей мікроорганізму. Більшість досліджень включає визначення чутливості до антимікробних препаратів у виділеного збудника. Для епідеміологічної оцінки ролі мікроорганізму проводять внутрішньовидову ідентифікацію визначенням фаговаров, биоваров, резістентваров і т.д.
Біологічні методи спрямовані на визначення наявності токсинів збудника в досліджуваному матеріалі і на виявлення збудника (особливо при незначному вихідному вмісті в досліджуваному зразку). Методи включають зараження лабораторних тварин досліджуваним матеріалом з наступним виділенням чистої культури патогена або встановленням факту присутності мікробного токсину та його природи. Моделювання експериментальних інфекцій у чутливих тварин - важливий інструмент вивчення патогенезу захворювання і характеру взаємодій всередині системи мікроорганізм-макроорганізм. Для проведення біологічних проб використовують тільки здорових тварин певних маси тіла і віку. Інфекційний матеріал вводять всередину, в дихальні шляхи, внутрішньочеревно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно і підшкірно, в передню камеру ока, через отвір трепанації черепа, субокципітально (в більшу цистерну головного мозку). У тварин прижиттєво забирають кров, ексудат з очеревини, після загибелі - кров, шматочки різних органів, СМЖ, ексудат з різних порожнин.
Серологічні методи виявлення специфічних АТ і Аг збудника - важливий інструмент в діагностиці інфекційних захворювань. Особливу цінність вони мають в тих випадках, коли виділити збудник не представляється можливим. При цьому необхідно виявити підвищення титрів АТ, в зв'язку з чим досліджують парні зразки сироватки, взяті в інтервалі 10-20 діб (іноді цей інтервал може бути більш тривалим). АТ зазвичай з'являються в крові на 1-2-й тиждень захворювання і циркулюють в організмі відносно довго, що дозволяє використовувати їх виявлення для ретроспективних епідеміологічних досліджень. Визначення класів Ig чітко характеризує етапи інфекційного процесу, а також може бути непрямим прогностичним критерієм. Особливе значення мають методи виявлення мікробних Аг. У значних кількостях вони з'являються вже на самих ранніх термінах, що робить їх ідентифікацію важливим інструментом експрес-діагностики інфекційних захворювань, а кількісне їх визначення в динаміці інфекційного процесу служить критерієм ефективності проведеної антимікробної терапії.
Алергологічні методи. Аг багатьох збудників володіють сенсибілізуючої дії, що використовують для діагностики інфекційних захворювань, а також при проведенні епідеміологічних досліджень. Найбільшого поширення знайшли шкірно-алергічні проби, які включають внутрішньошкірне введення Аг (алергену) з розвитком реакції ГЗТ. Шкірні проби знайшли застосування в діагностиці таких захворювань як сап, мелиоидоз, бруцельоз. Найбільш відома проба Мантђ, використовувана як для діагностики туберкульозу, так і для оцінки несприйнятливості організму до збудника.
Методи виділення та ідентифікації бактерій
У цьому розділі розглянуто наступні питання: підготовка матеріалу для мікроскопії та види мікроскопії, поживні середовища для культивування бактерій, посів і культивування бактерій, вивчення особливостей росту бактерій для їх первинної ідентифікації, а також біохімічні, серологічні, алергологічні та біологічні методи ідентифікації бактерій.
Будь-яке бактеріологічне дослідження починається з мікроскопії матеріалу і його подальшого посіву на поживні середовища. Ефективність виділення збудника в значній мірі обумовлена правильною технікою відбору зразків клінічного матеріалу, своєчасністю їх доставки в лабораторію і правильним зберіганням зразків.
Для світлової мікроскопії застосовують мікроскоп - оптичний прилад, що дозволяє спостерігати дрібні об'єкти (рис. 11 -1). Збільшення зображення досягають системою лінз конденсора, об'єктива і окуляра. Конденсор, розташований між джерелом світла і досліджуваним об'єктом, збирає промені світла в поле мікроскопа. Об'єктив створює зображення поля мікроскопа всередині тубуса. Окуляр збільшує це зображення і робить можливим його сприйняття оком. Межа дозволу мікроскопа (мінімальна відстань, на якому помітні два об'єкти) визначається довжиною світлової хвилі і апертурою лінз. Теоретично можлива межа дозволу світлового мікроскопа дорівнює 0,2 мкм; реальний дозвіл можна підвищити за рахунок збільшення апертури оптичної системи, наприклад, шляхом збільшення коефіцієнта заломлення. Коефіцієнт заломлення (імерсії) рідких середовищ більше коефіцієнта заломлення повітря (n = 1,0), при мікроскопірованіі застосовують кілька іммерсійних середовищ: масляну, гліцеринову, водну. Механічна частина мікроскопа включає штатив, предметний столик, макро- і мікрометричний гвинти, тубус, тубусодержатель.
И верстка Малюнок 11-01
Темнопольна мікроскопія дозволяє спостерігати живі бактерії. Для цього використовують темнопольний конденсор, який виділяє контрастують структури незабарвленого матеріалу. Перед початком роботи світло встановлюють і центрують по світлому полю, потім светлопольний конденсор видаляють і замінюють відповідною системою (наприклад, «ОІ-10» або «ОВ-21»). Препарат готують за методом «роздавленої краплі», роблячи його якомога більш тонким (товщина покривного скла не повинна бути товще 1 мм). Спостережуваний об'єкт виглядає як освітлений на темному полі. При цьому промені від освітлювача падають на об'єкт збоку, а в лінзи мікроскопа надходять тільки розсіяні промені (рис. 11 -2). Як иммерсионной рідини придатне вазелінове масло.
И верстка Малюнок 11-02
Мал. 11 -2. Схема світлового мікроскопа з темнопольним конденсором. Пояснення в тексті.
Фазово -контрастная мікроскопія дозволяє вивчати живі і нефарбовані об'єкти за рахунок підвищення їх контрастності. При проходженні світла через пофарбовані об'єкти відбувається зміна амплітуди світлової хвилі, а при проходженні через незабарвлені - фази світлової хвилі, що використовують для отримання висококонтрастного зображення в фазово-контрастної (рис. 11 -3) і інтерференційної мікроскопії. Для підвищення контрастності фазові кільця покривають металом, що поглинає пряме світло, не впливаючи на зрушення фази. В оптичній системі мікроскопа застосовують спеціальний конденсор з револьвером діафрагм і центрує пристроєм; об'єктиви замінюють на імерсійним об'єктиви-апохромати.
И верстка Малюнок 11-03
Поляризаційна мікроскопія дозволяє отримувати зображення нефарбованих анізотропних структур (наприклад, колагенових волокон, міофібрил або клітин мікроорганізмів). Принцип методу заснований на вивченні об'єкта в світлі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно перпендикулярних площинах.
Інтерференційна мікроскопія об'єднує принципи фазово-контрастної і поляризаційної мікроскопії. Метод застосовують для отримання контрастного тривимірного зображення нефарбованих об'єктів. Принцип методу заснований на роздвоєнні світлового потоку в мікроскопі; один промінь проходить через об'єкт, інший - повз нього. Обидва промені з'єднуються в окулярі і інтерферують між собою.
Люмінесцентна мікроскопія. Метод заснований на здатності деяких речовин світитися при впливі короткохвильового випромінювання. При цьому випускаються світлові хвилі довше хвилі, що викликає світіння. Іншими словами, флюоресцирующие об'єкти поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють в іншій області спектра (рис. 11 -4). Наприклад, якщо индуцирующее випромінювання синє, то утворюється світіння може бути червоним або жовтим. Ці речовини (флюоресцеин ізоцианат, акридіновий помаранчевий, родамін і ін.) Використовують як флюоресцирующие барвники для спостереження флюоресцирующих (люминесцирующих) об'єктів. У люмінесцентному мікроскопі світло від джерела (ртутна лампа надвисокого тиску) проходить через два фільтри. Перший (синій) фільтр затримує світло перед зразком і пропускає світло довжини хвилі, збудливою флюоресценцію зразка. Другий (жовтий) затримує синє світло, але пропускає жовтий, червоний, зелений світло, що випромінюється флюоресцирующим об'єктом і сприймається оком. Зазвичай досліджувані мікроорганізми забарвлюють безпосередньо або за допомогою АТ або лектинів, помічених флюорохромами. Препарати взаємодіють з Аг або іншими зв'язують ліганд структурами об'єкта. Люмінесцентна мікроскопія знайшла широке застосування для візуалізації результатів імунохімічних реакцій, заснованих на специфічній взаємодії мічених флюоресцирующими барвниками АТ з Аг досліджуваного об'єкта. Варіанти імунофлюоресцентних реакцій представлені на рис. 11 -5 і 11 -6.
И верстка Малюнок 11-04.
И верстка Малюнок 11-05
Мал. 11 -5. Пряма імунофлюоресценція. Прямий метод передбачає використання помічених флюоресцирующим барвником АТ до цікавого Аг; АТ взаємодіють з Аг в місцях їх локалізації, що і дозволяє візуалізувати мітка.
И верстка Малюнок 11-06.
Мал. 11 -6. Непряма імунофлюоресценція. Непрямий метод передбачає використання двох різних АТ. Перші АТ реагують з Аг мікроорганізму, другі АТ (пов'язані з міткою) специфічно взаємодіють з першими АТ, які є Аг до других АТ. Метод значно чутливіші, ніж пряма імунофлюоресценція, так як з кожною молекулою перших АТ зв'язується кілька молекул друге АТ.
Теоретично дозвіл просвічує електронного мікроскопа складає 0,002 нм; реальний дозвіл сучасних мікроскопів наближається до 0,1 нм. На практиці дозвіл для біологічних об'єктів досягає 2 нм.
Трансмісійний електронний мікроскоп (рис. 11 -7) складається з колони, через яку в вакуумі проходять електрони, які випромінюються катодного ниткою. Пучок електронів, фокусна кільцевими магнітами, проходить через підготовлений зразок. Характер розсіювання електронів залежить від щільності зразка. Що проходять через зразок електрони спостерігають на флюоресцируют екрані і реєструють за допомогою фотопластинки.
Скануючий електронний мікроскоп застосовують для отримання тривимірного зображення поверхні досліджуваного об'єкта.
И верстка Малюнок 11-07.
Підготовка матеріалу до мікроскопії
В бактеріологічній практиці мікроскопічно досліджують незабарвлені зразки (нативний матеріал) і пофарбовані препарати (мазки або мазки-відбитки), приготовлені з клінічного матеріалу або колоній виросли мікроорганізмів.
Нативні препарати готують для дослідження живих нефарбованих бактерій. Найбільшого поширення набули метод висячої краплі. мікрокамери з щільними середовищами і негативні методи дослідження живих бактерій. Для прижиттєвого дослідження також часто застосовуються дослідження в темному полі і фазово -контрастная мікроскопія. Подібні прийоми часто використовують для діагностики сифілісу і попередньої діагностики діарей, викликаних кампілобактерами, а також для визначення рухливості мікроорганізмів.