Фарбування мікропрепаратів для виявлення джгутиків,
капсул, суперечка і зерен волютина
виявлення джгутиків
Джгутики бактерій дуже тонкі і легко відриваються. Тому виявити їх можна тільки при спеціальній забарвленням або за допомогою електронного мікроскопа.
Виявити джгутики у бактерій, застосувавши звичайні способи забарвлення аніліновими барвниками неможливо.
Джгутики, як правило, стають видимі, якщо препарат попередньо обробити протравов, а потім пофарбувати. Протравлений препарат легше сприймає забарвлення, але найголовніше те, що джгутики при осадженні на них протрави збільшуються і стають видимими при мікроскопірованіі.
Існують різні способи забарвлення джгутиків, але в кожному окремому випадку в залежності від індивідуальних властивостей мікробів доводиться вибирати той чи інший спосіб.
Для успішної забарвлення джгутиків повинні дотримуватися такі умови:
1. Чистота предметних і покривних стекол повинна бути ідеальною.
2. Препарат повинен готуватися зі свіжої агаровой суспензії культури не старші добової, а для деяких видів (вібріон, сінна паличка) які не досягли 12 годин. Частина матеріалу, взяту з посівної риси (ближче до конденсаційної воді), де більше вологи переносять в пробірку з 1 - 2 мл стерильної водопровідної води. Пробірки витримують 30 60 хвилин при кімнатній температурі, потім суспензію бактерій переноситься в краплю стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину, нанесену на покривне скло. При розподілі матеріалу на покривному скельце, треба бути обережним, щоб механічно не пошкодити джгутики інеї відірвати їх від тіла бактерій.
Мазок повинен бути тонким, щоб особини могли розташуватися ізольовано один від одного.
Воду на склі слід розподіляти тонким шаром, щоб прискорити висихання препарату і зменшити втрату джгутиків.
Найбільш часто для фарбування джгутиків використовують спосіб Леффлера (Loffler). Методика забарвлення:
1. На висушений і зафіксований мазок наливають протраву в такій кількості, щоб покрити всю поверхню покривного скельця, і витримують 3 - 5 хвилин при кімнатній температурі.
2. Після закінчення зазначеного часу препарат обережно і ретельно промивають проточною водою.
3. На препарат наносять розчин фуксину (1 частина насиченого спиртового розчину фуксину на 10 частин води) і препарат прогрівають над полум'ям до появи пара.
4. Препарат промивають водою і проводять мікроскопію.
Приготування протрави для виявлення джгутиків бактерій:
12г таніну розчиняють при нагріванні в 48 мл води і до цього розчину додають 30 мл насиченого розчину фуксину в 95% етиловому спирті. Розчин фільтрують і зберігають в скляній ємності з притертою пробкою. Протрава готова до вживання через кілька днів після приготування і може зберігатися протягом декількох місяців.
Для виявлення джгутиків у найпростіших препарати можна фарбувати простим способом, використовуючи метиловий синій, розчин Люголя або складним методом за Романовським - Гімза.
Виявлення капсул у бактерій
Капсули не володіють вираженим спорідненістю до основних фарбників, тому для виявлення капсул застосовують різні способи приготування мікропрепаратів і їх забарвлення, з огляду на особливості освіти і збереження капсул у різних видів бактерій.
Для виявлення капсули необхідна наявність пофарбованого всередині капсули фону і пофарбованого зовнішнього фону.
Внутрішній фон представлений пофарбованої мікробної клітиною, що знаходиться всередині капсули. А зовнішній фон, навколишній капсулу, може бути природним або штучним.
Якщо мікроб зберігає капсулу постійно, тобто не тільки всередині макроорганізму, а й на живильному середовищі (клебсієли), то препарат для виявлення капсул можна приготувати з культури, вирощеної in vitro на живильному середовищі. І в такому випадку зовнішній фон створюється штучно.
Якщо мікроб утворює і зберігає капсулу тільки всередині макроорганізму (збудники сибірської виразки, чуми, пневмококи), то в такому випадку робиться мазок - відбиток з ураженого органу загиблого макроорганізму (з печінки, селезінки, лімфатичних вузлів) або з мокротиння, вмісту бубон, крові. Зовнішній фон капсули буде представлений тканинними клітинами.
Мікропрепарат з культури клебсієл для виявлення у них капсули можна забарвити за методом Буррі - Гінса:
1. На чисте предметне скло наноситься невелика крапля чорної туші і крапля суспензії добової агарового культури капсульних бактерій. Суміш обережно перемішується петлею. після чого іншим предметним склом робиться мазок, подібно мазку крові.
2. Після підсушування на повітрі і фіксації в полум'я пальника препарат дофарбовують протягом 2 - 3 хвилин карболовим фуксином Циля, розведеним дистильованою водою 1: 1.
3. Після закінчення препарат обережно промивається струменем холодної води, висушується і проводять мікроскопію. На темному тушевие тлі будуть видні пофарбовані мікробні клітини оточені безбарвною капсулою. При відсутності капсули, до клітки пофарбованої фуксином, чорний фон примикає впритул.
У тому випадку, якщо микропрепарат готується з досліджуваного матеріалу, мазок може бути пофарбований одним аніліновим барвником, за методом Грамма, за методом Романовскго - Гімза. У кожному з цих трьох споосбов забарвлення на тлі забарвлених тканинних клітин, буде видно безбарвна капсула, навколишнє забарвлену мікробну клітину. Виявлення спор.
Завдяки товщині своє оболонки і щільності вмісту, суперечки залишаються незабарвленими при обробці препарату аніліновими барвниками простим методом або складним по Граму.
При фарбуванні за Грамом або по Леффлеру спору всередині пофарбованої цитоплазми мікробної клітини виглядає як зернятко круглої або овальної форми, сильно переломлює світло.
Існує кілька методів забарвлення суперечка (по Ціль - Нільсеном, по Ганзеном, по Ожешко та ін.) Дозволяють досягти контрастного фарбування суперечка в цитоплазмі.
Методика забарвлення мікропрепарату:
1) На фіксований препарат накладається смужка фільтрувального паперу (для захисту препарату від осідають кристалів барвника) і на неї наливається карболовий фуксин Ціля. Препарат обережно прогрівається протягом 3 - 4 хвилин над полум'ям пальника. У міру випаровування рідини барвник додається.
2) Фільтрувальний папір знімається і на мазок наноситься 2 - 3 краплі 5% розчину кислоти (сірчаної, соляної, азотної або оцтової) на 30 секунд.
3) Препарат ретельно промивається струменем холодної води і висушується.
4) дофарбовував розчином метиленової сині Леффлера протягом 1 - 2 хвилин.
5) Препарат промивається струменем води, висушується і проводять мікроскопію. На блакитному тлі цитоплазми видно бузково - червоні суперечки.
Цей метод дозволяє виявити суперечки не тільки в процесі їх формування всередині клітини, а й після того як сформована спору висипалася з зруйнованої мікробної клітини.
Приготування карболового фуксину Циля:
10 мл. насиченого спиртового розчину фуксину розчиняють в 100 мл 5% розчину карболової кислоти.
Виявлення зерен волютина
Зерна волютина (запасні речовини поліфосфатного природи) можна виявити в клітинах багатьох мікроорганізмів.
У бактерій і актиноміцетів гранули волютина розташовуються в цитоплазмі, у дріжджів та грибів - в вакуолях. Як правило, зерен волютина більше в молодих клітинах.
У незабарвленому стані великі зерна волютина виділяються від решти плазми більшою светопреломляемостью. Однак краще наявність зерен волютина визначається в забарвлених препаратах. Для виявлення зерен волютина застосовується забарвлення метилової синню по Леффлеру. Зерна волютина при цьому забарвлюються в синьо - фіолетовий колір, а протоплазма - в блакитний.
Диференціальна забарвлення зерен волютина може бути досягнута різними способами забарвлення, в тому числі і способом Нейссера (Neisser). Нейссер розробив і запропонував для виявлення зерен волютина в клітинах дифтерійних бактерій.
При фарбуванні за способом Нейссера зерна волютина фарбуються в синій або темно - коричневий колір, а протоплазма - в світло - коричневий.
Зерна волютина можна виявити забарвленням за способом Омелянського. Для цього на фіксований мазок наливають карболовий фуксин Ціля на 30 секунд. Після чого фарбу зливають, препарат промивають водою і знебарвлюють протягом 30 - 40 секунд 1% розчином сірчаної кислоти. Потім кислоту зливають, препарат промивають водою і дофарбовують метиловим синім в розведенні 1:40 протягом 30 секунд. Після промивання водою препарат висушують і проводять мікроскопію.
Зерна волютина при цьому способі забарвлення фарбуються в бузково - червоний колір і добре видно на тлі синьої цитоплазми.
При фарбуванні препарату за методом Грама зерна волютина по тональності та інтенсивності забарвлення не диференціюються від цитоплазми, тому забарвлення за Грамом для виявлення зерен волютина застосовувати не має сенсу.
У деяких мікроорганізмів запасні речовини накопичуються у вигляді гранул вуглеводної природи. Їх можна виявити при обробці клітин розчином Люголя. Гранули крахмалоподобних речовин фарбуються в синій, а гранули глікогеноподобних полісахаридів - в червонувато - коричневий колір.
Фарбування мікропрепаратів з досліджуваного матеріалу
Мікропрепарати з крові фарбують за Романовським - Гімза, фуксином, метиловим синім або іншими аніліновими барвниками.
Для спостереження вегетативних стадій кишкових найпростіших користуються прижиттєвої забарвленням паразитів розчином Люголя, слабкими розчинами основних барвників (еозин, метиловий синій і ін.) В розведенні 1: 1000 і навіть 1: 10000. Для більш докладного вивчення паразитів, препарати фіксують рідкими фіксаторами (рідина Шаудін , метиловий або етиловий спирт) і забарвлюють гематоксиліном, метиловим синім, фуксином, фарбою Романовського.
При мікроскопічному дослідженні мазків сечі, спинномозкової рідини, мокротиння фіксовані препарати забарвлюють по Граму, за Романовським - Гімза, метиловим синім
Фіксовані мікропрепарати з гнійного вмісту виразок, пунктатов бубонов, лімфатичних вузлів залежно від передбачуваного збудника забарвлюють по Граму, по Бурі, за Романовським - Гімза, сріблення по Морозову.