Рік народження А.Нікітін невідомий. Украй мізерні і відомості про те, що змусило цього купця зробити в кінці 1460-х в ризиковану і тривалу подорож на Схід, в бік трьох морів: Каспійського, Аравійського і Чорного. Його він описав в своїх нотатках, озаглавлених Хожение за три моря.
Точна дата початку подорожі також не відома. У 19 ст. И.И.Срезневський датував його 1466-1472, сучасні російські історики (В.Б.Перхавко, Л.С.Семенов) вважають точної дату 1468-1474. Згідно з їхніми даними, караван з декількох судів, який об'єднав російських торговців, відправився з Твері по Волзі влітку 1468. Перевірений купець Нікітін до цього не раз відвідував далекі країни - Візантію, Молдавію, Литву, Крим - і благополучно повертався додому з заморським товаром. Ця подорож також почалося гладко: Афанасій отримав грамоту від Великого князя Тверського Михайла Борисовича, збираючись розгорнути широку торгівлю в районі сучасної Астрахані (деяким історикам це повідомлення дало підставу бачити в тверском купця таємного дипломата, лазутчика тверського князя, проте документальних підтверджень того немає).
У Нижньому Новгороді Нікітін мав з метою безпеки приєднатися до російського посольства Василя Батькова, але той вже пішов на південь, і торговий караван його не застав. Дочекавшись повернення з Москви татарського посла Ширвана Хасан-бека, Нікітін з ним і з іншими купцями відправився в шлях на два тижні пізніше наміченого. Під самою Астраханню караван з посольського і купецьких судів пограбували місцеві розбійники - астраханські татари, не зваживши, що на одному з кораблів плив «свій» і до того ж посол. Вони відняли у купців весь товар, закуплений в кредит: повернення на Русь без товару і без грошей загрожувало борговою ямою. Товариші Афанасія і він сам, за його словами, «заплакавши, та розійшлися котрі куди: у кого що є на Русі, і той пішов на Русь; а кой повинен, а той пішов, куди його очі понесли ».
Бажання поправити справи за допомогою посередницької торгівлі погнало Нікітіна далі на південь. Через Дербент і Баку він потрапив до Персії, перетнув її від Чапакура на південному узбережжі Каспію до Ормуза на березі Перської затоки і по Індійському океану до 1471 році доплив до Індії. Там він провів цілих три роки, відвідавши Бидар, Джункар, Чаул, Дабхол і інші міста. Грошей він не нажив, але збагатився незабутніми враженнями.
Жваво і цікаво описав він і природу екзотичної Індії. Однак як купець Нікітін був розчарований результатами подорожі: «Мене обдурили пси-бусурмани: вони говорили про безліч товарів, але виявилося, що нічого немає для нашої землі. Дешеві перець і фарба. Деякі возять товар морем, інші ж не платять за нього мит, але нам вони не дадуть [нічого] провезти без мита. А мито велика, та й розбійників на морі багато ».